惊艳分析界的超分辨显微技术!

随着现代科学的技术的发展与需要,传统光学显微镜已远远不能满足科研工作的要求,发展一些新型的超分辨技术以适应不同领域工作的要求,是当前显微镜前进的目标。
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表面增强超分辨技术
现有超分辨技术在样品纵向图像的获取上可分为两类:
1. 通过增加可获取的信号纵深以更好地获取样品的三维图像,如双光子荧光显微技术等;
2.通过降低可获取的信号纵深以更好地获取样品表面的图像,如等离子结构照明显微技术(PSIM)基于芯片的宽视场纳米显微术(CWN)等。
下面主要介绍第2类技术中的两种新型前沿显微技术,二者都是利用特殊材料的样品作为载物台对照明光进行有效的调制,以增强样品表面的成像效果。
等离子结构照明显微技术
PSIM是于2014年由WeiFF等在传统结构光照明显微(SIM)原理的基础上利用表面等离子体干涉(SPI)代替光学干涉,从而获得达到SIM两倍分辨率的新型超分辨显微技术,该技术的关键在于对表面增强拉曼散射(SERS)的应用。
近年来,SIM由于其光毒性低、成像速度快、适用于观察活细胞等优点得到了越来越广泛的应用,然而传统SIM由于原理上的限制只能达到衍射极限两倍左右的成像分辨率。PSIM将SIM与可调制的SPI结合起来,用SPI序列作为新的照明光源代替传统SIM中的激光干涉条纹,利用振镜扫描实现条纹变化,通过重建达到了相当于传统SIM两倍的分辨率
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图1 PSIM技术下的直径为100 nm的荧光颗粒。(a)传统的荧光显微;(b)重建的PSIM图像;(c)对应的SEM图像;(d-e)a,b两图的傅里叶变换,黄色虚线代表光学传递函数。(f)蓝色的为传统荧光成像的截面强度分布,绿色和红色为PSIM重建后的两个轴向分布
相比之下,PSIM主要有以下优点:
1.高分辨率。
与传统SIM技术和SSIM技术相比,PSIM的优势在于在不减帧速且不利用饱和荧光效应的前提下获得高分辨率的显微图像。
2.高信噪比。
倏逝波在垂直方向上快速衰减,通过将激发光限制在样品表面一个很小的区域内即可得到较高的信噪比。
3.成像分辨率不依赖于NA。
PSIM原理上不依赖于NA的限制,利用较小NA的物镜仍可获得比SIM更高分辨率的图像。
4.极大的应用前景。
对于诸如哺乳动物细胞等需要对其表面进行观测的样品,PSIM是一种能够较好地解决衍射极限问题、同时还具备较高对比度的成像手段。这种技术将在高速超分辨领域内产生巨大的影响。
芯片照明超分辨
基于芯片的CWN,简称芯片照明超分辨,利用照明光在波导片与样品界面处产生的瞬逝场使得样品仅在表面极薄的部分得到激发,从而减弱获取信号中背景信息的干扰,实现超分辨
CWN技术是由Grandin等在2006年提出的,并由Diekmann等在2017年进行改进。Diekmann等利用波导片实现了照明光与探测光的完全分离,在原有的平板波导的基础上研制了可控能力更强的肋形波导和带状波导,如图2所示,将复杂的光学功能集成在以波导片为主体的通用平台上。
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图2 波导片a.在原有平板波导的基础上部分蚀刻可制成肋形波导;b.在原有平板波导的基础上完全蚀刻至SiO2底板可制成带状波导。两种情形下波导通道的宽度都是25-500 μm
CWN的主要优点有:
1.波导片的应用将激发光路完全从显微系统中分离出去,使用时无需考虑光路的耦合,大大降低了整套设备的复杂度;
2.波导片利用光在高折射率材料和周围介质(水或细胞)间的界面上发生全内反射的原理,高效地利用瞬逝场照明样品;
3.由于其对照明光在空间上的严格限制,图像具有较高的信噪比;
4.由于照明光与成像光的物镜非相关,因此可以随意根据需要更换不同放大倍数/分辨率的物镜;
5.由于该技术对光信号的利用效率高,使用NA较小的物镜即可在获得较大视场的同时,确保图像的分辨率不至于太差。
利用两种互补的技术———ESI技术和直接STORM(dSTORM)技术,展现了基于波导芯片的超分辨荧光显微成像技术的功能。这项技术解决了一直以来存在于超分辨显微技术中的缺陷,提高了超分辨显微系统的应用性能,有极大的市场价值和开发前景。
此外,该技术为研究者提供了新的思路,基于芯片的激光产生、过滤和调制技术将为超分辨显微领域带来发展的新动力。
可以预见,未来的超分辨显微领域将会因为光子集成电路的发展而再次产生较大的飞跃。
上述几种新型的超分辨技术在不同的应用中各有所长,为光学成像领域带来了新的曙光。随着人们对生命科学领域的不断深入探索,超分辨技术也将会继续发展以满足不同的应用需求。
(内容来源:网络 由小析姐整理编辑)
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